鐵皮石斛（Dendrobium catenatum）是一種珍貴的傳統(tǒng)中草藥，屬于蘭科石斛屬的多年生草本植物。它因其表皮常呈現(xiàn)鐵綠色而得名。它在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有著悠久的應(yīng)用歷史，被譽(yù)為“九大仙草”之首，主要分布在安徽、浙江、福建、廣西、四川和云南等地。

多年以來，包括鐵皮石斛在內(nèi)的蘭科植物在分子育種上面臨諸多挑戰(zhàn)，如以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率不高、操作繁瑣等問題。蘭花不僅種類繁多，而且每種基因型對遺傳轉(zhuǎn)化的響應(yīng)各不相同，使得基因的轉(zhuǎn)化工作既耗時又低效。更棘手的是，蘭花有漫長的幼年期，阻礙了基因功能的研究。此外，作為單子葉植物，蘭花相比雙子葉植物而言，更難以通過農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，因為后者是農(nóng)桿菌的天然宿主。因此，尋找有效的蘭科植物的轉(zhuǎn)化與再生體系迫在眉睫。

    近日，深圳市蘭科植物保護(hù)研究中心（蘭科中心）科研人員及其合作者在BMC Genomics期刊在線發(fā)表了題為“MIR396-GRF/GIF enhances in planta shoot regeneration of Dendrobium catenatum”的研究論文，報道了MIR396-GRF/GIF分子調(diào)控模塊增強(qiáng)鐵皮石斛植株再生和遺傳轉(zhuǎn)化的研究。

    生長發(fā)育調(diào)節(jié)因子GRFs是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在轉(zhuǎn)錄后水平受到miR396靶向調(diào)控，能夠與其互作蛋白GIFs形成功能復(fù)合體。miR396-GRF/GIF分子模塊被報道參與水稻、玉米、擬南芥、小麥等植物的分生組織分化、植株再生、遺傳轉(zhuǎn)化和植物生長發(fā)育等過程，但在蘭花中的功能研究報道較少。

    為了提高鐵皮石斛遺傳轉(zhuǎn)化效率，研究人員借鑒了在小麥、水稻、柑橘、西瓜等作物中利用小麥（Triticum aestivum）生長發(fā)育調(diào)節(jié)因子TaGRF4及其互作蛋白TaGIF1構(gòu)成的人工嵌合蛋白（TaGRF4-GIF1）有效提高植株再生和基因編輯效率的方法，文章首先在鐵皮石斛全基因組范圍內(nèi)鑒定獲得與TaGRF4和TaGIF1蛋白序列高度相似的DcGRF4和DcGIF1。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，DcGRF4的序列上含有miR396的結(jié)合位點，暗示DcGRF4可能在轉(zhuǎn)錄后水平受到miR396的靶向負(fù)調(diào)控。

    基于此，科研人員進(jìn)一步克隆了相關(guān)基因并構(gòu)建了含有TaGRF4-GIF1、DcGRF4-GIF1，突變形式的mTaGRF4-GIF1、mDcGRF4-GIF1，以及miR396的靶標(biāo)模擬物MIM396的植物雙元表達(dá)載體（AB）。此外，研究人員還嘗試了一種鐵皮石斛在體轉(zhuǎn)化技術(shù)，將攜帶有上述載體的農(nóng)桿菌注射到鐵皮石斛莖段傷口處，直接誘導(dǎo)芽體再生。經(jīng)過觀察統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)GRF4-GIF1和MIM396等轉(zhuǎn)化植株比空載體對照的芽體再生效率顯著提高，且再生芽體中轉(zhuǎn)基因陽性率也大幅提升（CD）。有趣的是，MIM396再生植株的株型及葉片比對照更大（E），與miR396-GRF/GIF分子模塊對生長發(fā)育的調(diào)控作用相符。此外，文章發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶中豐富的營養(yǎng)及潮濕的環(huán)境有利于GRF4-GIF1發(fā)揮芽體再生調(diào)控作用（FGH）。

    總之，該研究在鐵皮石斛中發(fā)掘并應(yīng)用了一類生長調(diào)節(jié)因子GRFs，充分發(fā)揮了其在植株再生、轉(zhuǎn)化和生長中的調(diào)控作用，對加快鐵皮石斛以及蘭科植物的分子育種工作具有促進(jìn)作用。

    深圳市蘭科植物保護(hù)研究中心王志才副研究員、王美娜副教授、上海師范大學(xué)明鳳教授為本論文通訊作者，蘭科中心和上海師范大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)博士生楊振宇和蘭科中心助理工程師趙美麗為本論文共同第一作者。蘭科中心與新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)已畢業(yè)碩士研究生張曉捷、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)谷麗麗副教授，蘭科中心李健博士也參與了此項工作。本研究得到了深圳市科技計劃面上項目和深圳市可持續(xù)發(fā)展項目的支持。

    論文鏈接：https://doi.org/10.1186/s12864-024-10360-9

    文圖丨楊振宇

    審核丨陳建兵 王美娜